如何加强CAR-T疗效：单CAR双CAR？二代三代……-技术前沿-资讯-生物在线

如何加强CAR-T疗效：单CAR双CAR？二代三代……

作者：IsoPlexis 2021-12-30T23:21 (访问量:10154)

众所周知，CAR-T结构包括三部分：

1、识别靶抗原的胞外scFv区；

2、跨膜铰链区；

3、胞内信号结构域，以介导T细胞信号转导，引起T细胞活化、扩增和抗肿瘤免疫应答等。

CAR-T细胞疗法的发展。（图片来自Journal of Controlled Release, 2020, 319:246-261.）

其中胞外区结构决定了CAR的特异性和与靶抗原的结合亲和力。随着CAR-T的发展，逐渐发现单靶点CAR-T细胞疗效受限于肿瘤抗原的异质性，常出现肿瘤复发的问题，于是近年来逐渐向多靶点CAR-T细胞疗法转变，比如探索CD19/CD20双特异性CAR治疗复发难治性B细胞淋巴瘤等。

另外，胞内结构域近年来也做了不断优化。从二代CAR开始，就加入了不同的共刺激信号结构域，以解决一代CAR在体内存活时间较短，且活性差的问题。二代CAR-T技术依据不同的共刺激结构域主要分为两大类：基于CD28和基于CD137(4-1BB)的共刺激结构域。一般认为，CD28所传递的活化信号相较于CD137(4-1BB)更强，可使T细胞在较短时间内达到很高的杀伤活性。而CD137(4-1BB)所传递的活化信号则会更加持久。

到三代CAR-T同时引入两个共刺激信号分子，以期提高T细胞增殖活性、细胞毒性，并延长T细胞存活时间。第四代CAR-T结构引入了**基因、促炎症细胞因子和共刺激配体等，希望达到精细调控和克服肿瘤免疫微环境抑制等目的。

关于如何将CAR-T胞外和胞内的结构域进行优化，强强联合，以提高CAR-T的作用，目前仍在探索中。

墨菲特癌症治疗及研究中心(H.Lee Moffitt Cancer Center and Research Institute)Marco L Davila博士带领的研究团队新近在Journal for ImmunoTherapy of Cancer（影响因子13.751）发表题为"4-1BB and optimized CD28 co-stimulation enhances function of human mono-specific and bi-specific third-generation CAR T cells "的研究文章表明，4-1BB和经过优化的CD28共刺激信号可增强三代单特异性CAR和双特异性CAR的功效，包括细胞扩增、细胞持久性和抗耗竭能力等。

研究方法

作者设计了4-1BB或联合仅含有PYAP信号基序(mut06)的CD28作为CD19特异性CAR-T细胞的共刺激信号，通过细胞和分子生物学体外和体内实验对不同设计结构的CAR-T细胞进行评估，包括：

体外细胞分析：免疫表型、细胞因子分泌、实时细胞毒杀伤能力和CAR-T多功能性反应；

体外蛋白定量：Western blot分析不同CAR-T的LCK募集情况；

小鼠体内肿瘤模型实验：在NOD scid γ (NSG)小鼠模型中分析CAR-T对Raji细胞肿瘤的控制。

此外，作者还结合4-1BB和mut06设计了双特异性CD20/CD19 CAR，并采取以下实验进行评估：

多次体外抗原刺激：分析细胞扩增能力、细胞记忆性表型、PD1+CD39+表型（细胞耗竭）；

小鼠肿瘤模型：在Raji或Nalm6小鼠肿瘤模型中研究双特异性CAR-T细胞清除CD20/CD19肿瘤细胞的能力。

思路理清楚了，我们来看下研究结果吧~

研究结果

一

4-1BB和mut06共刺激可提高CAR-T细胞的记忆性表型

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为了评估4-1BB和mut06联合刺激如何影响CAR功能，研究人员一共设计了5种CAR结构，具体如下：

所有CAR结构包括FMC63 scFv胞外区和CD8α跨膜铰链结构域，不同之处在于胞内的共刺激信号。

h1906z (mut06)：与CD28子结构域相比，h1906z用FMNM和ARRA取代了YMNM和PRRP，只留下一个功能性的PYAP信号基序；

h1906BBz：在细胞膜近端是mut06结构域，然后依次是4-1BB和CD3ζ；

h19BB06z：在细胞膜近端是4-1BB结构域，然后依次是mut06和CD3ζ。

将不同设计的CAR-T细胞与靶细胞(3T3-hCD19)以1:10的效靶比共培养24小时，流式检测CAR-T细胞表型，结果显示：

h19BB06z细胞表面的CAR表达水平最高，与靶细胞刺激前趋势一致。

在与靶细胞共培养后，同时含有4-1BB和mut06共刺激信号的CAR-T（h1906BBz和h19BB06z）具有更高的CD4/CD8比例，同样与靶细胞共培养前的趋势一致。

在与靶细胞共培养后，同时含有4-1BB和mut06共刺激信号的CAR-T（h1906BBz和h19BB06z）细胞含有更高比例的中央记忆性T细胞(CCR7+CD45RA-)。

为了进一步验证在更长时间点的细胞分化情况，研究人员每周用靶细胞刺激CAR–T，共计3周。结果显示h19BB06z CAR-T细胞能够保持更持久的高比例中央记忆性细胞表型，而其余的CAR-T偏向T细胞分化表型。

综上，与其他CAR-T结构相比，h19BB06z CAR-T细胞可以保持更持久、更高水平的中央记忆性细胞表型。

二

4-1BB和mut06共刺激结构域影响h1906BBz和h19BB06z CAR-T细胞的功能

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对CAR-T细胞的功能检测包括细胞因子定量、细胞多功能性检测、体外杀伤实验和胞内信号转导分析。

细胞因子检测

为了检查不同CAR的效应功能，研究人员将三名健康人来源的CAR-T细胞与靶细胞以1:10的效靶比共培养24小时，收集上清检测细胞因子含量。

结果显示：

h1906z (mut06)的IFN-γ、IL-2和TNFα水平最低，与CD28结构突变导致的信号传导抑制和功能受损有关；

当4-1BB与mut06共刺激信号联合时，细胞上清中IFN-γ、IL-2和TNF-α的分泌增加，尤其是h19BB06z；

IL-6的分泌与患者的CRS相关，在所有CAR结构中均保持较低水平，除了h19BB06z。

细胞多功能性检测

此外，研究人员还探索了CAR-T细胞的多功能性，即单个细胞分泌两种及以上细胞因子的能力。已有多项研究表明，CAR-T细胞的多功能性是体内生理效应的一个重要预测指标。为了验证这一点，作者采用微流控芯片，在单细胞水平上分析了数百个CAR-T细胞分泌的28种细胞因子，包括分泌频率和细胞因子强度。

将CAR-T细胞与靶细胞共培养4小时后加载到芯片进行分析，结果发现h1928z、h1906BBz和h19BB06z的多功能细胞百分比增加。细胞多功能指数（PSI）是衡量CAR-T细胞疗效的预测性指标，通过计算多功能细胞的百分比乘以所分泌的各种细胞因子的强度获得。采用这一检测方法显示，h1928z、h1906BBz和h19BB06z具有最高的PSI水平。这些数据说明4-1BB和mut06结合可以增强CAR-T细胞的多功能性，与h1928z相当。

体外杀伤能力检测

所有CAR-T在两种效靶比下（5:1和1:1）都具有快速有效的杀伤作用。这表明体外细胞毒作用不受共刺激域的选择或组合的影响。

CAR-T细胞胞内信号转导分析

淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)是影响CAR-T细胞功能的关键信号转导分子。最近有研究表明，LCK募集到4-1BB CARs可以增强CAR-T细胞的细胞毒性。研究人员对不同CAR在靶细胞刺激24h后的胞内LCK磷酸化水平进行了分析，发现与第二代CARs相比，第三代CARs的pLCK均有所增加。

而且，h19BB06z的LCK磷酸化水平最高，说明共刺激域的位置可能会影响pLCK。此外还发现大量的pLCK和总LCK与h19BB06z CAR分子相关。这些数据表明，h1906BBz和h19BB06z的体外功能增强是由于pLCK的增加，共刺激区域的定位可影响CAR相关的LCK信号。

三

共刺激域定位影响细胞体外扩增和体内肿瘤杀伤

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CAR-T体外持续扩增能力

衡量CAR-T细胞体内功效的一种指标是在多轮抗原刺激后的扩增能力。鉴于此，研究人员用5:1效靶比的靶细胞刺激CAR-T细胞，每7天重复刺激一次，共计4周，检测CAR-T细胞反应性。

结果显示在重复抗原刺激后，h19BB06z CAR - T细胞表现出最强的体外扩增能力、细胞毒作用和细胞因子分泌。

而h1906BBz CAR-T细胞比h19BB06z表现出更低的增殖、细胞毒作用和IL-2的产生，再次表明共刺激域定位可以影响CAR功能。

体内抗肿瘤能力

为了确定h1906BBz和h19BB06z CAR-T细胞在体内控制肿瘤生长的能力，研究人员将Raji B淋巴细胞肿瘤细胞注射到NSG小鼠体内形成肿瘤。结果发现，与UT和h1906BBz相比，h19BB06z CAR-T细胞能够更好地控制肿瘤生长。在接受h19BB06z治疗的小鼠血液中，CAR+细胞略有增加，CD19+细胞相应减少。