利用培养基富集: 富集培养法指利用特定培养基和培养条件使混合微生物菌群中某种或某类特定微生物比例激增从而分离目标微生物的培养方法。在选择培养基中加入能够抑制其他微生物生长繁殖的因子也可以促进目标微生物的分离。针对共生细菌的特征先富集培养,再筛选,有利于分离到一些难培养的共生菌。
在厌氧条件下Paul等用不含氮源的AM5培养基(Headspace:N2-CO2 (80:20 [V/V]))从高等白蚁Cubitermes ugandensis和马陆Anadenobolus sp.肠道分别富集到一个能产甲烷的混合菌群,菌群中古菌热原体(Thermoplasmatales)含量很高。尽管最终没有分离纯化出单一的热原体菌株,通过对混合菌群中热原体16S rRNA基因和产甲烷菌mcrA 基因的系统发育分析和比较,揭示了在象白蚁肠道中存在的热原体是一类新的产甲烷古菌,命名为甲烷原体(Methanoplasmatales),这类甲烷菌是古菌中能够产甲烷的第7个目。在黑翅土白蚁(Odontotermes formosanus)、黄翅大白蚁(Macrotermes barneyi)和象白蚁Nasutitermes sp.等高等白蚁肠道内均发现有很多热原体古菌,其功能一直不明确。该研究首次证实了热原体的产甲烷活性,阐明了这类共生古菌的功能,具有重要的理论意义。
在很多研究中,人们往往可以从肠道微生物的富集培养中进一步分离筛选到一些难培养的微生物。例如,李丹红等以滤纸为唯一碳源在好氧条件下从象白蚁Nasutitermes sp.肠道富集到一个能高效降解纤维素的混合菌群,进一步优化培养基之后从该菌群中成功分离到一株能够降解纤维素的类芽胞杆菌。
对于难培养的昆虫肠道共生微生物,整合使用多种技术进行分离筛选是值得尝试的一种策略。Stevenson等将分子生物学技术引入到传统细菌分离培养过程中,从土壤和白蚁肠道中分离出了一些新的未培养微生物。他们首先将稀释的土壤样品和白蚁肠液接种于寡营养培养基琼脂平板,在微氧条件下培养30d,以抑制富营养菌和好氧菌的生长。待单菌落长出后,将其转移至96孔细胞培养板,同时以群特异性引物对菌落细胞进行16S rRNA基因扩增,以初步鉴定菌落中细菌的种类,然后根据鉴定结果针对性地设计培养条件,将感兴趣的细菌分离纯化出来。这种新的培养策略可以有目的地筛选环境中的特定微生物,具有很大的应用潜力。利用该策略,他们首次成功地从黄肢散白蚁肠道分离到了4株疣微菌,进一步研究表明疣微菌很可能参与了白蚁的固氮作用。
在大多数昆虫肠道内共生菌的种类很多,形态、大小及生理生态特性相差很大。针对共生细菌的形态特征,可以用物理方法将它们初步分开,再进行筛选,这种策略也有利于分离到一些难培养的共生菌。例如,在木食性白蚁、蟑螂及一些甲虫肠道内分布着的迷踪菌(Elusimicrobia),是这些昆虫肠道内的一种优势共生菌,形态为细纺锤形、细杆状、球状或不定形,直径为0.17- 0.30 μm,其功能一直不明确。根据其形态大小,Geisinger用0.22 μm滤膜对甲虫Pachnoda ephippiata肠液匀浆进行过滤,从滤液中成功分离到首株迷踪菌菌株Elusimicrobium minutum并对其基因组进行了分析。用同样的策略,Zheng首次从桑特散白蚁肠液中分离到了一株迷踪菌Endomicrobia proavitum,研究表明该菌具有Ⅳ型固氮酶,在无氨的培养基中可以固氮。
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TLC法鉴别 海龙(尖海龙) 中药对照药材 121485-200401 1.0g
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TLC法鉴别 鹿角(马鹿) 中药对照药材 121487-200401 0.5g
TLC法鉴别 溪黄草(浅纹香茶菜) 中药对照药材 121488-200401 2.5g
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