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    细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术， 而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。以下来具体讲一下细胞培养的步骤。

    细胞培养的步骤

    一、细胞复苏：

    1. 将新鲜培养基置于37℃水浴锅中回温，回温后喷以75%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。如配置：50mL完全培养基(含10%FBS，1%青链霉素双抗)44.5mL基础培养基 + 5mL FBS + 0.5mL青链霉素双抗。

    2. 戴防护手套后，自液氮罐中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，立即放入37℃水槽中快速解冻（避免冰晶重新结晶而造成细胞死亡），轻摇冷冻管使其在2分钟内全部融化，以75%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。

    3. 将解冻的1mL细胞悬液缓缓加入细胞培养瓶内，再向瓶中加入10mL完全培养基(稀释比例为1:10)，混合均匀，放入37℃，5%CO2的恒温培养箱中培养。取0.1ml解冻细胞悬液作存活测试。(Sf9细胞在27℃生长，可不需CO2)

    4. 一般而言，细胞大都不需立即去除冷冻保护剂(例如DMSO)。若要立即去除，则将解冻的细胞悬液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心 1300rpm，5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。

    二、传代培养：

    1. 37℃恒温培养约48小时，待细胞长满80-90%后，从培养箱取出75cm2培养瓶，倒掉培养基。加入5mLPBS缓冲液吹打以洗去残留血清，倒掉缓冲液。

    2. 沿壁（无细胞的一面）缓缓加入1mL胰酶溶液消化细胞约1min，轻轻摇晃，倒掉残余胰酶，将培养瓶置于恒温箱中约1min，拿出培养瓶轻轻拍打一下细胞贴壁的一面。

    注意：最佳消化温度是37℃，加液后用移液管反复吹打分散细胞。

    3. 向瓶中加入5mL完全培养基，反复吹打均匀2min，从中取出20μl至0.5ml小离心管中，向管中加入80μl台盼蓝溶液，混匀，从混合液中取出10μl至盖好盖玻片的计数板上，计算细胞密度及活率。

    4. 将5mL细胞悬液全部吸出，分别接种1mL悬液到原培养瓶和另一新的培养瓶中，其余舍弃。再向两瓶中各加入10mL完全培养基，置于CO2培养箱培养。（细胞传代时按1：5或更大比例稀释）

    三、细胞计数与存活测试：

    1. 取10μl混合液自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色。

    2. 计数四个大方格的细胞总数。计数板计数时，最适浓度为5～10×105细胞/ml。高浓度细胞悬液，可取出部分稀释后计数。

    3. 每一大格的体积为0.1cm×0.1cm×0.01cm= 10-4ml。若细胞位于线上，只计左线与上线的细胞。

    注：细胞密度= 四大格细胞总数×稀释倍数×104/4= 细胞数/ml；

    细胞活率= 活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。                         

    四、细胞冻存：

    1. 冷冻前确保细胞处于指数生长期，传代后的5mL细胞悬液取出1mL接种到培养瓶继续传代。另取一无菌离心管，将剩余4mL细胞悬液置于其中，离心1000rpm，5min（转速勿超过1500rpm）。

    2. 离心后倒掉上层清液，收集下层细胞沉淀。向离心管中加入900ul完全培养基，用枪头反复吹打重悬起细胞。取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率。一般细胞浓度为2~5×106cells/ml较适宜。

    3. 将细胞悬液转入1.5mL无菌冻存管中，再加入100ul试剂级DMSO，混匀，制成细胞冻存悬液（DMSO最后浓度为10％）。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期，然后进行冻存。

    注意：对Sf9细胞而言，冻存比例为：95%培养液+5%DMSO。

    5. 传统方法：冷存管置于4℃10分钟→-20℃30分钟→-80℃16~18小时（隔夜）→液氮罐长期储存。（-20℃勿超过1小时，防止胞内冰晶过大造成细胞死亡）