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表观转录组+翻译组实验揭示 tRNA 的 m7G 修饰如何影响食管鳞癌中的蛋白翻译效率

作者：上海云序生物科技有限公司 2022-12-01T13:53 (访问量:6139)

m7G 修饰最常见于成熟 mRNA 的 5' 帽子结构当中，然而除此之外，在 mRNA 内部以及多种非编码 RNA 当中也有发现 m7G 修饰的存在，这其中就包括 tRNA。然而，tRNA 的 m7G 修饰对于与 mRNA 翻译效率的作用仍然有待阐明。在 2022 年 3 月发表于 Nature Communications 上的一篇论文当中，来自中山大学附属第一医院等机构的研究人员在食管鳞癌细胞中通过 m7G 修饰测序发现了带有 m7G 修饰的 tRNA，并通过 Ribo-seq 等翻译组学实验找出了这些 m7G 修饰的 tRNA 与 RPTOR/ULK1/自噬通路蛋白翻译效率之间的关系。

论文标题：N⁷-methylguanosine tRNA modification promotes esophageal squamous cell carcinoma tumorigenesis via the RPTOR/ULK1/autophagy axis
发表期刊：Nature Communications（IF= 17.694）
研究方法：LC-MS 核酸修饰水平检测、tRNA m7G 修饰测序、核糖体印记测序（Ribo-seq）、mRNA qPCR

研究思路图

1、ESCC 当中的 METTL1/WDR4 表达升高，且与不良预后相关
METTL1/WDR4 复合体是人类细胞当中催化 tRNA 发生 m7G 修饰的甲基化转移酶（即“Writer”）。作者在 TCGA 数据库中发现多种癌症当中都存在 METTL1 和 WDR4 的 mRNA 水平升高的现象，其中就包括食管鳞癌（后简称 ESCC, 即 esophageal squamous cell carcinoma）。在作者收集的 ESCC 临床患者的癌组织中（n=6），mRNA qPCR 和蛋白质 Western blot实验也发现 METTL1/WDR4 在 mRNA 和蛋白质水平均相比于对照组发生上调。针对 METTL1 或 WDR4 蛋白的组织免疫染色（IHC）结果更显示，METTL1 或 WDR4 蛋白水平越高，病人的预后就越差。

2、敲降 METTL1 或 WDR4 可抑制 ESCC 肿瘤发展
作者在 ESCC 细胞系当中敲降 METTL1 基因，结果发现细胞增殖减缓、聚落形成能力减弱。流式细胞仪分选结果也显示，METTL1 敲降组的凋亡细胞比例增加。作者还在小鼠当中进行了人源 ESCC 细胞移植的体内实验，发现注射 METTL1 敲降 ESCC 细胞的小鼠相比于注射普通 ESCC 细胞的对照组小鼠拥有更缓慢的肿瘤生长速度、更小的肿瘤体积和重量。细胞增殖标记蛋白 Ki67 的免疫组化染色结果也显示，METTL1 敲降细胞在小鼠体内降低了肿瘤细胞的增殖能力。
作者随后也针对另一个 m7G Writer 基因 WDR4 进行了敲降，收到了与 METTL1 敲降类似的体外和体内实验结果，说明敲降 WDR4 也可抑制 ESCC 的肿瘤发展。

3、METTL1 在 ESCC 中促进 m7G tRNA 修饰，进而促进 mRNA 翻译
作者对 ESCC 细胞当中提取的 tRNA 进行了 m7G 修饰测序，发现了 19 个发生 m7G 修饰的 tRNA。这些 tRNA 上的 m7G 位点显示出 ABGWY 的 motif 序列特征。相比于对照组，METTL1 敲降组当中的 tRNA m7G 修饰水平显著下降。作者更换 LC-MS 实验方法（n=3）再次检验 m7G 修饰的整体水平，发现 METTL1 敲降组确实低于对照组。tRNA 测序的结果还显示，METTL1 敲降会大大降低含有 m7G 修饰的 tRNA 的水平，但对其它种类的 tRNA 却几乎没有影响。针对 tRNA 进行的 Northern blot 实验结果也发现 METTL1 敲降/过表达会降低/升高受 m7G 修饰的 tRNA 水平（其中包括 ValAAC 和 LysCTT 这两种 tRNA），这一现象进一步证明 METTL1 可通过发挥 m7G 修饰酶的功能来提升受 m7G 修饰的 tRNA 的水平。

作者随后也针对另一个 m7G Writer 基因 WDR4 进行了敲降/过表达实验，收到了与 METTL1 敲降/过表达类似的 m7G 修饰 tRNA 调控效果，说明 METTL1/WDR4 复合体可通过发挥 m7G 修饰酶的功能来提升受 m7G 修饰的 tRNA 的水平。

作者对 METTL1 敲降细胞以及对照细胞进行了多聚核糖体分析（Polysome profiling assay），发现 METTL1 敲降可以抑制 mRNA 翻译活动（多聚核糖体下调）。蛋白质合成抑制剂嘌呤霉素的摄入实验（Puromycin intake assay）亦显示 METTL1 敲降可抑制 mRNA 翻译活动。作者由此认为，METTL1 介导的 m7G tRNA 修饰对于 tRNA 的表达以及 mRNA 的翻译发挥了不可或缺的作用。

4、METTL1 通过 m7G 修饰的 tRNA 所对应的密码子起到 mRNA 翻译限速的作用
为了深入研究异常 tRNA m7G 修饰导致的蛋白翻译失常，作者对 METTL1 敲降细胞以及对照细胞进行了多聚核糖体测序（Polyribosome-seq），并计算了测序结果当中 mRNA 上的 m7G 修饰的 tRNA 所对应的密码子的数量。结果显示，mRNA 上 m7G 修饰的 tRNA 所对应的密码子越多，翻译效率（Translation efficiencies, TE）也就越低。针对这些翻译效率降低的基因所做的 GO 分析和 KEGG 通路分析结果显示，这些基因大多与细胞自噬以及 mTOR 信号通路相关。作者进一步对 METTL1 敲降细胞以及对照细胞进行了核糖体印记测序（Ribo-seq），发现 METTL1 敲降后翻译效率降低的 mRNA 拥有更多数量的 m7G 修饰 tRNA 所对应的密码子，并且 METTL1 敲降会使得翻译活动停顿在 m7G 修饰 tRNA 所对应的密码子位置上。Ribo-seq 所发现的这些结果证明，METTL1 介导的 tRNA m7G 修饰对于 mRNA 的翻译是不可或缺的。针对 Ribo-seq 结果当中组间差异翻译的 mRNA 进行的 GSEA 分析结果也显示，METTL1 对于细胞自噬负调控相关基因以及 mTOR 信号通路相关基因呈正相关关系。

针对细胞自噬负调控基因以及 mTOR 信号通路相关基因的 mRNA qPCR 以及 Western blot 结果显示，METTL1 敲降主要降低这些基因所编码的蛋白质的表达水平，但是在 mRNA 水平却没有明显的影响。多聚核糖体-qPCR 实验进一步证明了 RPTOR（mTOR 复合体1相关调控蛋白， Regulatory Associated Protein of mTOR Complex 1 ）的翻译效率受到 METTL1 敲降的负调控。早前的研究已知 mTOR 信号通路通过 ULK1 蛋白上的 ser785 位点磷酸化来负调控细胞自噬，于是作者通过 Western blot 检测了 METTL1 敲降细胞当中普通 ULK1 蛋白、磷酸化 ULK1 蛋白，以及细胞自噬标记蛋白 LC3-II、LC3-I 的蛋白水平，发现普通 ULK1 蛋白增加，而磷酸化 ULK1 蛋白减少，并且 LC3-II/LC3-I 比值上升，说明 METTL1 敲降可增加细胞自噬。总而言之，METTL1 通过 tRNA 的 m7G 修饰促进 mTOR 信号通路基因的翻译，进而对细胞自噬起到了负调控作用。

5、METTL1 通过 RPTOR/细胞自噬轴来影响 ESCC 肿瘤发展
作者在 METTL1 敲降的 ESCC 细胞中过表达 RPTOR，发现细胞增殖和聚落形成能力得到恢复，并且可以增加 ULK1 细胞的磷酸化水平，降低 LC3-II/LC3-I 比值，消除细胞自噬流（Autophagic flux）。因此，作者认为 RPTOR 确实是 METTL1 调控的下游靶标。

作者随后在 METTL1 敲降的 ESCC 细胞中敲降 ULK1，以确定 METTL1 和 RPTOR 是否通过调节 ULK1 介导的自噬来促进 ESCC 的进展。结果显示，METTL1 敲降细胞当中的 ULK1 敲降可以挽救 ESCC 细胞的生长，并且可以消除细胞自噬流。除了 ULK1 以外，作者还选用了另外两个细胞自噬负调控基因 VPS34 和 BECN1 进行了敲降实验，得到了与 ULK1 敲降类似的结果。以上现象证明，METTL1 通过 RPTOR/细胞自噬轴来影响 ESCC 发展。

6、体内实验证明 METTL1 的条件敲除可抑制 ESCC 肿瘤发生

作者在小鼠当中进行了上皮组织特异性 METTL1 条件敲除（Conditional knockout, cKO），并对 cKO 组小鼠和对照组小鼠都施用 DNA 烷化剂 DEN 和激酶抑制剂 sorafenib 以诱导 ESCC 的肿瘤发生。结果显示，对照组小鼠的食管出现了明显的 ESCC 肿瘤发生，但 cKO 组的 ESCC 发生数以及受损区域都要比对照组小得多。组织免疫染色结果也显示，cKO 组小鼠的 METTL1 以及细胞增殖标记蛋白Ki67 染色都更深。针对 RPTOR 的 mRNA qPCR、蛋白 Western blot 以及免疫组化染色实验结果也证明，METTL1 的 cKO 处理降低了 RPTOR 蛋白水平，但对 mRNA 水平几乎没有影响。Northern blot 实验结果还发现， METTL1 的 cKO 处理降低了 m7G 修饰水平。免疫荧光染色实验还发现，cKO 组当中的 LC3 蛋白水平明显高于对照组，说明 METTL1 的 cKO 处理增强了细胞自噬现象。总而言之，METTL1 介导的 tRNA m7G 修饰在体内可促进 ESCC 肿瘤发生。

7、METTL1/WDR4 介导的 tRNA m7G 修饰促进 ESCC 发展
作者还进行了功能增益研究（Gain-of-function studies），在 ESCC 细胞系中分别进行了野生型 METTL1 过表达以及无催化活性的突变型 METTL1 过表达，结果发现只有野生型 METTL1 过表达才能增强 ESCC 细胞的生长和聚落形成能力，提升 RPTOR 蛋白表达水平，并降低细胞凋亡和自噬现象。

作者随后也对 WDR4 基因进行了类似的野生型/突变型功能增益实验，得到了与 METTL1 类似的结果。总而言之，METTL1/WDR4 介导的 tRNA m7G 修饰可以促进 ESCC 的发展。

8、体内实验证明 METTL1 促进 ESCC 肿瘤发生
作者在小鼠体内进行了上皮组织特异性 METTL1 条件敲入（Conditional knockin，cKI），并对 cKI 组小鼠和对照组小鼠都施用 DNA 烷化剂 DEN 和激酶抑制剂 sorafenib 以诱导 ESCC 的肿瘤发生。结果显示，cKI 组小鼠的食管形成了大型的肿瘤，但在对照组当中 ESCC 发生数以及受损区域都要小得多。免疫组化染色结果也显示，cKI 组小鼠体内含有更高的 METTL1 和 Ki67 蛋白表达水平。Northern blot 实验结果也显示 cKI 组当中的 tRNA m7G 修饰水平升高。mRNA qPCR 和 Western blot 结果则显示，在 cKI 组当中，RPTOR 蛋白水平上升，但 RPTOR 的 mRNA 水平几乎不变。综上所述，METTL1 催化的 tRNA m7G 修饰促进了 ESCC 的肿瘤发生。

总结

综合本文当中的多种实验结果，作者总结出这样的一套分子机制：METTL1/WDR4 在 ESCC 中高表达，以维持 tRNA 上的 m7G 修饰。若敲降 METTL1/WDR4，m7G 修饰的 tRNA 便会下调，致使需要使用到 m7G 修饰的 tRNA 进行翻译的 mRNA 的蛋白翻译效率下降——这些蛋白翻译下降的基因，许多富集在细胞自噬负调控通路，最终使得细胞自噬活动增强，减弱了 ESCC。而在 ESCC 癌组织当中，高表达的 METTL1/WDR4 则通过相反的调控方式，降低了细胞自噬活动，最终导致了肿瘤发生。

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