吉玛公司RNAi设计原则

吉玛公司以国际上最先进的设计理念为依托，综合我们对RNAi文库筛选以及从客户反馈的结果，吉玛公司优先考虑的设计原则有以下几个方面：

1. siRNA 设计原则

1.siRNA双链末端的热稳定性，即 的值

2.siRNA双链的反义链末端最后两个碱基的选择，即：20，21位置碱基的选择

3.siRNA双链的反义链第1和第19位置的碱基的选择

4.siRNA反义链的G+C的含量

5.siRNA反义链的第2位和第18位置的碱基的选择

6.siRNA反义链的第2位到17位局部稳定性的选择

7.siRNA双链的正义链为基准，整个双链稳定性的分布为，5’末端稳定性强，双链中间段，以断裂位点周围为例，稳定性较弱，3’段稳定性较弱

Sense:

5’            NNNNNNNNNNNNNNNNNNN TT

3’

antisense:

3’       NN  NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

5’

mRNA:

5’     dNdN  NNNNNNNNNNNNNNNNNNN

3’

注：正义链sense:   19碱基的靶点+TT悬头

反义链antisense:21个碱基完全与靶点互补

反义链最后两个碱基为脱氧核酸dNdN

2.shRNA设计原则

shRNA设计原则与siRNA设计原则相比有其特殊性。源于shRNA的siRNA相对于外源导入的siRNA在细胞内的有效浓度要低。shRNA末端设计以及双链的热稳定性是以DNA设计为基础，而siRNA是以mRNA为基础。

1．  从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA或者NA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。正义链和反义链都采用这19个碱基(不包括AA或者NA重复)来设计。

2．   避免在起始密码子或无义区域附近选择目的序列。

3．   siRNA序列的GC含量应为30%-60%左右。

4．  在设计siRNA时不要针对5'和3'端的非编码区（untranslated regions，UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

5．   将挑选的序列在公共数据库中进行比较以确保目的序列与其它基因没有同源性。

6．  将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）。由于没有完整的基因组序列，比对起来相对困难。

7．    选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。

8．  阴性对照:一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样需要检查它和其他基因是否具有同源性。

9．有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别，因为这个突出端无需和靶序列互补。合成siRNA时可直接提供以AA打头的21个碱基序列。