大鼠硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)ELISA试剂盒使用说明书               

目    的：                                             

       本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)的含量。

检测范围：                                         

0.313-20 ng/mL 仅供参考,检测范围可根据您的实验要求定做.

最低检测限：

0.07 ng/mL

大鼠硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)ELISA试剂盒实验原理：

       本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中大鼠硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)，再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB 显色。TMB 在HRP酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD  值），通过标准曲线计算样品中大鼠硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)浓度。

试剂盒组成：

大鼠硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)ELISA试剂盒样本处理及要求：

1.  血清：室温血液自然凝固  10-20  分钟，离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。

仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

2.  血浆：应根据标本的要求选择  EDTA  或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合  10-20  分钟后，

离心 20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

3.  尿液：用无菌管收集，离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

4.  细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心  20  分钟左右（2000-3000

转/分）  。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用  PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到  100  万/ml  左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

5.  组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的  PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保

存备用。标本融化后仍然保持  2-8℃的温度。加入一定量的  PBS（PH7.4）  ，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心  20  分钟左右（2000-3000  转/分）  。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

6.  标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能

马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

7.  不能检测含  NaN3  的样品，因  NaN3  抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

大鼠硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)ELISA试剂盒操作步骤：

1.  标准品：其浓度为20 ng/mL贮液)。先将其稀释为20 ng/mL(标准曲线最高浓度)后，再准备5个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入500μL 的标准品稀释液，例如图所示依次倍比稀释成50ng/mL-25ng/mL-12.5ng/mL-6.25ng/mL-3.125ng/mL-1.5625ng/mL,此依次倍比稀释仅供参考，标准品稀释液(0pg/mL)直接作为空白孔。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

 2.  加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）  、待

测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液  40μ l，然后再加待测样品  10μ l（样品最终稀释度为  5  倍）   。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.  温育：用封板膜封板后置  37℃温育  30  分钟。

4.  配液：将  20  倍浓缩洗涤液用蒸馏水  20  倍稀释后备用。

5.  洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置  30  秒后弃去，

如此重复  5  次，拍干。

6.  加酶：每孔加入酶标试剂  50μ l，空白孔除外。

7.  温育：操作同  3。

8.  洗涤：操作同  5。

9.  显色：每孔先加入显色剂  A50μ l，再加入显色剂  B50μ l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15  分钟.

10.  终止：每孔加终止液  50μ l，终止反应（此时蓝色立转黄色）  。

11.  测定：以空白空调零，450nm  波长依序测量各孔的吸光度（OD  值）  。  测定应

在加终止液后  15  分钟以内进行。

注意事项：

1． 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡  15-30  分钟后方可使用，酶标包被板开封后

如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间

最好控制在  5  分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4． 请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本  OD

值大于标准品孔第一孔的  OD  值）  ，请先用样品稀释液稀释一定倍数（n  倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）  。

5．  封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

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