产品内容:

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存。

产品说明：

NADK（EC 2.7.1.23）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是目前所发现的生物体 内唯一能够催化 NAD+磷酸化生成 NADP+的酶，可催化 NAD（H）以 ATP 或无机多聚磷酸[poly(P)] 作为磷酰基供体进行磷酸化反应，生成 NADP（H）。因此，NAD 激酶在合成 NADP（H）以及调节 NAD（H）与 NADP（H）的平衡上具有重要作用。 NADK 催化 NAD+磷酸化生成 NADP+，NADP+可被 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为 NADPH；在 340nm 下测定 NADPH 增加速率。可反应出 NADK 活性的大小。

自备仪器和用品：紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

操作步骤: 

一、粗酶液提取： 

1、 细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声 波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min， 取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、 血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤和加样表：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂一和试剂二 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）水浴 15min 以上。

3、工作液一的配制：在试剂三中加入 12mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保 存，禁止反复冻融。 工作液二的配制：在试剂四中加入 12mL 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、加样表

加完试剂混匀，室温静置 15min，340nm 下测定吸光值，ΔA＝A 测定-A 对照。

三、NADK 活性计算：

1、 血清（浆）NADK 活性

单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK（nmol/min/mL）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷V 样÷T =53.59×ΔA

2、 组织、细菌或细胞 NADK 活性

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（V 样×Cpr）÷T =53.59×ΔA÷Cpr (2) 按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟生成 1nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

NADK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V 样÷V 样总)÷T =53.59×ΔA÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。 NADK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总)÷T =0.107×ΔA V 反总：反应体系总体积，5×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色 皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，15 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。