细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 是应用新型的水溶性四唑盐2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐快速高灵敏度检测细胞增殖和细胞毒性的比色检测产品。

本四唑盐在电子载体存在的情况下能够被线粒体内的一些脱氢酶还原成橙黄色的水溶性的Formazan，生成的Formazan量与活细胞数量成正比。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数量呈线性关系。

CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中，不需要预配各种成分，CCK-8溶液很稳定，对细胞没有毒性，可以长时间孵育细胞。CCK-8法测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的灵敏度高，无放射性，检测细胞增殖实验的灵敏度比其它方法如MTT, XTT, MTS和WST-1高。

产品特点：

● 使用方便：仅使用单一试剂；

● 灵敏度高，数据可靠，重现性好，线性范围更宽；

● 结果稳定：试剂本身稳定性高，实验结果稳定可靠；

● 无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低；

● 适合于高通量药物筛选。

使用方法：

使用注意事项：

l   接种时注意细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接种几个孔就混匀一下。培养板周围一圈孔培养基容易挥发，为了减少误差，建议培养板的四边每孔只加培养基，而不作为指标检测孔。

l   培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。一般情况下，白细胞较难染色，因此需要较长的培养时间或增加细胞数量 (～105个细胞/孔)。悬浮细胞与贴壁细胞相比较难染色。对于悬浮细胞，在培养1- 4小时后，可先从培养箱中取出，目察染色程度或用酶标仪测定决定。若染色困难，可将培养板放回培养箱，继续培养数小时后再确定。染色的最佳时间可定为悬浮细胞的最佳培养时间。对于贴壁细胞，培养时间一般为1- 4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察染色程度 (根据细胞种类而定，需要摸索一下条件)。

l   有条件的情况下建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加 CCK- 8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰O.D值读数。

l   若细胞培养时间较长，培养基颜色发生变化或pH发生变化，建议更换新鲜的培养基后再加CCK- 8试剂。含有酚红的培养基可用于本试剂盒做细胞活性的测定。

l   如果不是使用96孔板检测，CCK-8溶液的用量相应等比例增加即可。

细胞活性、细胞增殖-毒性检测

1、收集细胞，加细胞悬液100ul（约5000-10000个细胞）到96孔板（边缘孔用无菌水或PBS填充）。每板设对照（加100ml培养基）。

　　2、置37℃，5% CO₂孵育过夜，倒置显微镜下观察。

　　3、每孔加入10 ul 待检测药物溶液， 37℃孵育。

4、每孔加入10 ul CCK-8溶液，37℃孵育1-4 小时。

5、测定450 nm各孔的吸光值，如无450nm滤光片，可以使用450-490nm的滤光片。

5、同时设置空白孔（培养基和CCK-8溶液，无细胞），对照孔（不加药培养基和CCK-8溶液，有细胞），每组设定3-5复孔。

  注：

1、如果暂时不测定O.D值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 ml 0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

2、如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。当然药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

细胞活力计算：

将各测试孔的OD值减去调零孔OD值或对照孔OD值。各重复孔的OD值取平均数。

细胞活力% =（加药细胞OD-空白OD/对照细胞OD-空白OD）×100

细胞数量测定

1、先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞。

2、按比例 (例如：1/2比例) 依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做3-5个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。

3、接种后培养2-4小时使细胞贴壁，然后加CCK-8试剂培养一定时间后测定O.D值，制作出一条以细胞数量为横坐标 (X轴)，O.D值为纵坐标 (Y轴) 的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量 (使用此标准曲线的前提条件是实验的条件要一致，便于确定细胞的接种数量以及加入CCK-8后的培养时间)。