DNA甲基化检测实验

一、重亚硫酸盐的测序法实验流程（BSP）（Bisulfite Genomic Sequence）

     原理：结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后，用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应（PCR）。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代，而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

     该方法特点是：

    1、特异性高，它能够提供特异性很高的分析结果，这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的；

    2、灵敏度高，可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。

重亚硫酸盐测序法技术实验流程

A． DNA制备

    用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B． 重亚硫酸盐处理

C． DNA纯化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

D． PCR扩增

E． PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化

F． PCR产物连接到pMD19-T (Takara) 载体中克隆及测序。

G． 用分析软件对各样本测序结果进行甲基化程度分析

二、甲基化特异性的PCR实验（methylation-specific PCR, MSP）

    原理：甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后，基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物，即一对结合处理后的甲基化DNA链（引物对M），另一对结合处理后的非甲基化DNA链（引物对U）。检测MSP扩增产物，如果用引物M能扩增出片段，则说明检测位点存在甲基化；若用引物U扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化（图3）。

该方法优点是：

1、  检测灵敏度高，样品消耗少，仅需1μg的基因组DNA，可用于石蜡包埋样本；

2、   快速、简单，省时；

3、  如果结合Real-time定量PCR技术（Taqman 探针）则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。

MSP技术实验流程

A．DNA抽提

用DNA抽提试剂盒（Promega, cat. no. A1125）抽提组织，细胞培养物，石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。

B. 重亚硫酸盐处理

C．DNA纯化

用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。

D．DNA脱磺基反应

E．甲基化特异性的PCR反应

针对改变后的DNA序列设计两对引物（M，U），进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。

实例：

检测肝癌细胞株Bel7405，Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后，针对改变的DAN序列设计两对引物

M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp

U：(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp

PCR扩增结果图

三、高分辨率熔解曲线（HRM）法 
       高分辨率熔解曲线分析技术（High Resolution Melting ），简称HRM，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型而及甲基化检测的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段长短、GC含量、GC分布及单个碱基差异等物理性质不同而造成DNA分子在加热变性时都会有不同的熔解曲线的形状和位置，并配合运用高浓度的饱和荧光染料，可以迅速的检测出核酸片段中GC含量和单碱基的突变。近年来，公司引进了RocheLightCycler® 480 II 和ABI VIIA7 全自动荧光定量PCR系统，为客户提供专业化、个性化的甲基化HRM检测服务。
操作流程：
a、 待测基因序列片段或位点甲基化引物设计（300bp以内）。
b、 利用甲基化转移酶修饰的DNA和非甲基化修饰的DNA制备标准品（0％，1％，5％，10％，20％，50％，100％梯度HRM标准曲线）
c、 亚硫酸氢盐处理样品DNA
d、上机检测
e、数据处理，形成报告（包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等）。
 实验实例：
     对2个病例的某基因20个CG位点进行检测，分析出不同的甲基化程度。
       
四、焦磷酸测序法 
       焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术是由4种酶（DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)）催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对，则会在DNA聚合酶的作用下，添加到测序引物的3'末端，同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术，通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。

操作流程：
a、DNA亚硫酸盐处理
b、用焦磷酸测序专门引物设计软件设计甲基化引物
c、进行PCR扩增预实验及正式实验
d、PCR产物上焦磷酸测序仪检测
 实验实例：

各种方案比较