腺病毒包装纯化实验

摘要： 利用AdMax系统在HEK293细胞中获取表达Oct-4-EGFP- 3FLAG的重组腺病毒，经扩增、纯化、检测后留待后续功能学研究。
关键词：AdMax， Oct-4， EGFP，重组腺病毒

一、 实验原理
腺病毒是一种无包膜病毒，直径在70～90nm。病毒颗粒由252个壳粒呈二十面体排列组成，每个壳粒的直径约为7～9nm。位于衣壳中的基因组是线状双链DNA，长度约为36 kb，两端各有长约100 bp的反向重复序列。腺病毒在自然界分布十分广泛，在很多哺乳动物和禽类中都有发现，其对上皮细胞，角膜和消化道上皮细胞具有一种天然的侵嗜性。现已发现的51种人腺病毒，根据组织嗜性不同被分成ABCDEF六个不同亚群，其中C亚群的第2和第5血清型最常被用于构建腺病毒载体。

腺病毒的双链DNA基因组分为编码区和非编码区。根据DNA复制周期的不同，编码区又分为早期基因区和晚期基因区。前者又细分为E1～E4四个区，主要负责编码调节蛋白；而后者分为L1～L5五个区，负责编码结构蛋白。腺病毒基因组中早期表达的调节蛋白可以调控晚期基因的表达，其中最先表达的是E1区基因，它所表达的蛋白(包括E2产物) 是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达所必需的。在非编码区，腺病毒双侧末端各含有一小段约100bp的末端反向重复序列(ITR)。ITR含有病毒进行复制和包装所必需的顺式作用元件及DNA复制起始点，它是病毒DNA复制所必需的，其内侧包含病毒包装信号(ψ)。
腺病毒作为一种病毒载体具有以下优点：（1）宿主范围广， 对人致病性低；（2）基因组信息完全清楚，易于操作，可以插入大片段的外源基因；（3）容易获得较高滴度；（4）不与基因组整合，瞬间表达，安全性较高；（5）可以感染多种人类细胞，（包括分裂期和非分裂期细胞）；目前较为成熟的载体系统有非复制型（如AdMax）和复制型（又叫溶瘤腺病毒）两种。
AdMax包装系统是由加拿大microbix公司经销，广泛被科研用户使用的腺病毒载体系统。它的工作原理是，利用Cre/loxP（或FLP/frt）重组酶将携带外源基因的穿梭质粒与骨架质粒在HEK293细胞中实现重组，产生腺病毒 （见AdmaxTM重组腺病毒流程图）。该系统具有操作简便、重组效率高、病毒产率高、目的基因表达水平高等优点，同时mCMV启动子较hCMV启动子的启动效率也要高出若干倍。

关于AdMax腺病毒包装系统的详情，请登陆网站：http://microbix.com/products/adenovirus-vectors/admax/

二、 实验目的
获取足够纯度和滴度的重组腺病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG。

三、 实验步骤
将目的穿梭质粒pAdeno-mCMV-Oct-4-EGFP-3FLAG与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒Adeno-Oct-4-EGFP-3FLAG，经大量扩增后纯化，检测滴度和目的基因表达水平后备用。实验步骤如下：
1. 病毒包装与鉴定：
1) 转染前一天，将细胞接种到6孔板中，控制细胞转染时的密度为70-80%。
2) 转染前一小时取出细胞培养板，去除原有细胞培养基，加入1.5ml的Opti-MEM培养基，将细胞放回培养箱。
3) 制备转染试剂和质粒的复合物：
a) 将待转染的病毒载体质粒4μg（骨架质粒：穿梭质粒=1:1）溶于Opti-MEM培养基，总体积为250 μl，轻轻混匀。
b) 将和元生物腺病毒包装转染试剂溶于Opti-MEM培养基，总体积为250 μl，轻轻混匀。
c) 将和元生物腺病毒包装转染试剂稀释液滴加到质粒稀释液中，边加边轻轻混匀后在室温放置20min，使DNA和转染试剂充分结合形成稳定的转染复合体。
d) 取出细胞培养板，将上面配好的DNA-转染试剂复合体加入到细胞培养板中，做好标记，放回培养箱。
e) 6h后吸去培养基，PBS洗一次，加入2ml新鲜完全培养基培养。
f) 每三天换液一次，大概7-15天左右出现病毒空斑，待完全病变后收集上清液。
2. 病毒大量扩增与纯化：
将HEK293细胞铺于30-40个10cm dish，待细胞长至70-80%，每块板加入合适滴度的病毒（约107-108PFU/ml）10 µl，感染细胞，待细胞全部病变后（2-3天），每块板中加入约500 µl 10% Nonidet P 40（NP40）以裂解细胞。收集细胞裂解物，12000 rpm离心10 min，弃细胞碎片收集上清。每100ml上清加入50 ml病毒沉淀液（20% PEG8000，2.5M NaCl），冰上放置1h以沉淀病毒。12000 rpm离心上述混合物20min，弃上清，将沉淀物悬浮在10 ml 密度为1.10g/ml的CsCl溶液中（溶剂为20 mM Tris-HCl，pH 8.0）4℃ 7000rpm离心5min，收集病毒悬浮液。
在超速离心管中加入2.0 ml的1.40g/ml CsCl 溶液（溶剂同上）。再加入3.0 ml 1.30 g/ml 的CsCl 溶液。最后加入5 ml的病毒悬浮液。22800 rpm，4℃离心2.5h。收集密度在1.30-1.40g/ml 之间的病毒条带至透析袋中(透析袋使用前用10 mM 的EDTA Na2煮沸10 min)。在透析缓冲液（50g蔗糖，10ml 1M pH为8.0的Tris-HCl液，2ml 1M MgCl2溶液定容至1000ml）中，4℃透析过夜，中间更换透析液一次。收集病毒，于-80℃保存。
三种密度的CsCl溶液配制如下（溶于灭菌20 mM Tris，pH8.0），4℃保存。

                                                                           CsCl溶液配制

3. 病毒滴定测定：
1) 选取状态良好的HEK293细胞，使用完全培养基重悬细胞，制备成5.0×105个/ml的细胞悬液，24孔板每个孔中种入1ml细胞，
37℃、5%CO2培养。
2) 准备好10倍梯度稀释的病毒样品，然后依次将10-5至10-8稀释的病毒液加入24孔板中，每孔加入100μl。
3) 37℃、5%CO2感染48h。轻轻的去除培养液，沿着24孔板侧壁缓缓加入预冷的甲醇500μl，-20℃固定20min。
4) 使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
5) 加入200μl 1%BSA 37℃封闭1h。
6) 加入200μl的一抗溶液至每个孔中，37℃孵育1h。
7) 使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
8) 加入200μl的二抗至每孔，37℃孵育1h。
9) 使用PBS轻轻的冲洗细胞3次，每次5min。
10) 加入200μl新配置的工作液至每孔，室温孵育5-10min。
11) 弃工作液，使用PBS清洗2次，每孔每次加入1ml PBS。
12) 每孔随机选择5个视野，使用光学显微镜10×物镜下计算阳性细胞个数。
13) 计算每孔阳性细胞的平均个数和病毒滴度。

4. 目的基因表达检测：
腺病毒感染工具细胞-293T，WB检测病毒表达情况（24孔板为例）。
第一天：细胞准备：
将长势良好的293T细胞接种到24孔板，消化好细胞后把细胞浓度调为1×105个/ml，按500μl/孔加入。接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30-50%之间。
第二天：病毒感染：
感染实验分两组，一组直接添加病毒液，一组同时添加。病毒液10倍倍比稀释，共三个稀释度，MOI值依次为100，10和1。每个MOI值加两个孔，取出一组加入感染增强剂，终浓度为5μg/ml。中间每隔15-20min摇晃一次培养板，增加感染效果。感染过程尽量使用无血清培养基。感染293T细胞无需Polybrene，无需无血清处理，直接按照MOI=1-10感染。
第二天：换液：
感染实验同一天，1.5-2h后（中间每半小时均匀摇晃一次，增加感染效率），弃去上清，换5%血清的培养基，500μl/孔。
(注：某些特殊细胞需要更换一半病毒液后，过夜，具体请咨询公司技术支持信箱：techservice@oobio.com.cn)
第三天：观察荧光表达情况：
在倒置荧光显微镜下观察荧光，估计腺病毒感染目的细胞的效率。对于生长缓慢的细胞，可以适当推迟一天观察的时间，以保持细胞良好的生长状态。通过细胞感染的效果，确认目的细胞的感染MOI。对于因目的基因较大，载体无法携带标记基因的，细胞感染腺病毒后大约48h后蛋白表达达到峰值。注：通常未知细胞感染腺病毒的最佳MOI值，需要首先选择96孔板进行摸索，后续放大的原则是保持细胞的密度不变，将培养基体积，病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大。即使这样，放大实验时由于体系的改变，加上预实验的MOI值设置跨度大小，需要对MOI的再次优化。MOI的设置值为预实验最佳值0.5倍，1倍和1.5倍或自己设置合理的数值。

                                                            病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值
           

*表中可培养板底参数数值为CORNING公司产品参数。
*对于孔面积较小的培养板，由于溶液张力的关系，培养基体积太少会导致病毒的分布不均与，所以不做减半处理。
293T感染24h-48h均可以收集样品进行WB检测

四、 实验结果

                                                                       包装荧光拍照质控结果
                
                                转染后第9天时观察，HEK293细胞大量飘落，细胞已经完全病变。

Adeno-Oct-4-EGFP滴度结果：
    本次实验在显微镜下５个视野中计算的阳性细胞平均数为8，此孔病毒稀释了107倍，根据以上公式得出：病毒滴度=8×79×107/0.1=6.32×1010（Ifu/ml）

                                                        滴度结果图片
                                                        

    备注：照片所拍摄的视野通常小于显微镜下观察的视野，因此需要在显微镜视野下计算阳性细胞的个数。

如没有检测滴度的试剂，可以直接检测腺病毒VP数，作为参考值，方法如下：
1. 要用Virus lysis buffer裂解腺病毒，取6μl病毒加入54μl Virus lysis buffer，第三次透析液为空白对照，做好标记。
2. 水浴裂解，56℃，10min。
3. 测dsDNA，OD260，首先用空白对照调零，然后放入样本读数，若在0.1-1.0之间，则可以准确反映病毒浓度，否则需要稀释或加浓。
4. 计算腺病毒浓度：病毒滴度=OD260×稀释倍数×1.1×1012（VP/ml）。
注：通常该方法检测的滴度值较PFU数值，偏高2个数量级，请参考。
5. 293T感染24h-48h均可以收集样品进行WB检测。
腺病毒常见问题：
关于腺病毒滴度单位：
1. VP测定法（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位）：
测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主要为DNA），1个OD值相当于1.1×1012个病毒颗粒。这种方法只能检测病毒的总颗粒数，而不能确定其中有感染活性的病毒颗粒。
2. GTU测定法（基因转移单位）： 
GTU测定感染后能表达报告基因的细胞数量。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在一个感染周期结束前立即测定表达报告基因的细胞。如果重组腺病毒含有报告基因如GFP或LacZ等则可以用这种方法进行测定。
3. PFU测定法（空斑形成单位）： 
PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培养中病毒空斑的形成。空斑形成需要许多个感染周期，得到最终结果通常需要三个星期。一般来说，这种方法得到的结果很少能在其它实验室重复。
4. 关于腺病毒保存和稀释方法：
若病毒量需长期保存，必须在-80℃保存，特别是纯化之后。在最佳的缓冲液（10mM Tris HCl pH 8.0，2 mM MgCl2，4% Sucrose）病毒会稳定1-2年，通常超过6个月后，应该重新检测滴度。病毒使用切记反复冻融，否则会降低病毒滴度。每次冻融导致病毒滴度降低10%左右。普通稀释液保存，每次冻融滴度损失会近一半。在DMEM中用血清保存的方式与纯化颗粒一致，但由于血清保护通常比在缓冲液中更加稳定。可以在DMEM中用血清在4℃存储病毒一周以上而不需要反复冻融。
5. 腺病毒在整体动物水平的使用：
体内试验的腺病毒，建议使用纯化过的病毒。因为小扩病毒中含有缺损颗粒、大量的腺病毒fiber和penton蛋白（细胞毒素）、培养基、血清以及细胞碎片。腺病毒用量范围在108-9PFU/只小鼠，每隔一天注射一次，共注射4次。小鼠肌注腺病毒后，3~4天目的蛋白的表达达到高峰，一周后逐渐下降，持续表达时间在两周左右。静脉注射小鼠（昆明鼠），半致死剂量LD50大约为1×1011v.p./只；裸鼠和SCID鼠可能更敏感一些。肌注方式的LD50测到：1×1012v.p./只给药，未发现小鼠死亡。
由于腺病毒在整体动物实验的复杂性和多样性，请直接将您的问题和建议与我们的动物工程师讨论，和元生物动物实验中心的腺病毒技术工程师也愿意与您分享他们在这一领域的经验，热线电话400-1515-198技术支持电子邮件techservice@oobio.com.cn。

五、 参考文献
1. Bewig, B., W. E. Schmidt (2000) Accelerated titering of adenoviruses. BioTechniques 28:870-873.