【实验目的】通过不同的实验方法，检测药物对细胞凋亡的影响。

【实验内容】

（1）琼脂糖凝胶电泳检测DNA ladder。

（2）Western blot 检测凋亡蛋白酶底物PARP的剪切。

【实验方法】分述如下：

1、DNA  Ladder

原理

细胞核染色质DNA 断裂是细胞凋亡的标志特征。在细胞发生凋亡时，核酸内切酶被激活，选择性降解染色质DNA，形成50-300 kbp 的大片段，并进而在核小体连接处断裂，形成180-200 bp 或其整倍数的DNA片段，这些DNA 片段可从细胞中提取出来，通过琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色呈现为梯状条带（DNA Ladder），并据此判断细胞凋亡产生。

结果判断

核DNA进行琼脂糖凝胶电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder特征；相比之下，正常细胞的DNA不降解，电泳条带表现为一大分子片段，如下图所示，1、2、3、4条带分别为4个不同的化合物诱导细胞产生的DNA ladder 照片。

2、PARP蛋白剪切的测定

  原理

聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶（PARP）为一种依赖Zn²⁺ 的真核DNA结合蛋白，可特异性地识别DNA断裂末端并结合，是一种重要的DNA修复酶。在细胞凋亡发生的早期， PARP是caspase家族（如caspase3 和caspase7）的作用底物，后者可使PARP的DNA 修复功能丧失。Caspase可将 113kD的PARP水解为89kD和24kD的两个片断。本方法主要

是运用抗PARP抗体，用蛋白印迹法（western blotting）检测PARP 89kD的裂解片断以及113kD完整的PARP蛋白，以作为细胞凋亡早期的标志物。可检测3x10⁵ 凋亡细胞的PARP裂解片断。

结果判断

显色反应的强弱与膜上条带PARP含量成正比，如下图所示，化合物A能诱导PARP剪切。