动物品种

SD大鼠

动物性别

雄性

动物规格

260-290g

造模方法

1.  体位：仰卧，固定

2.  备皮：剃毛、脱毛后进行术部消毒

3.  切口：颈部中线作纵向切口，约1cm

4.  钝性分离颌下腺及其他筋膜组织，拉钩牵引，暴露颈部两侧血管

5.  钝性分离左颈总动脉与迷走神经。分离颈外与颈内动脉、迷走神经与舌咽神经。

6.  颈总动脉结扎活结，颈外动脉结扎2个死结，颈内动脉结扎活结。

7.  颈外动脉从近心端死结下开口，插入线栓，活结扎紧。

8.  颈外动脉2个死结间剪断，牵引颈外动脉断端向下，与颈内动脉呈直线。

9.  将线栓伸至颈内动脉中，打解开颈内动脉活结，插入线栓（260~280g大鼠,插入深度约17mm,280g以上的大鼠,插入深度约18mm），会微遇阻力(此时小鼠出现略微挣扎现象)。此时线栓头端正好插入颈内动脉深部，固定线栓。缝合颈部切口，碘伏消毒，湿纱布覆盖创口等待再灌注。

10.  大脑中动脉阻塞45min后，再次麻醉，拔出线栓，结扎颈外动脉残端；

11.  解开颈总动脉活结，即可实现再灌注。 缝合，消毒，等待小鼠苏醒。

成模鉴定

（一）卒中动物脑血流测定

1.激光多普勒流量测定（LDF）

2. 激光散斑血流测定 (LSCI)：血流下降至术前70%-80%说明模型成功

3.磁共振脑血流测定

4.同步辐射血管造影

（二）常用卒中动物功能评估方法

● 朗格法-神经功能缺陷评分：5分制评分在动物麻醉清醒后24h进行(评分1-3分的小鼠，MCAO模型制备的成功性更可靠)

● 神经损害严重程度评分：卒中动物研究中最常见的神经学量表之一是改良后的神经损害严重程度评分(modified neurological severity score，mNSS)。mNSS 的满分为14 或18 分，取决于测试对象是小鼠或大鼠。mNSS 包括运动(肌肉状态和异常运动)感觉(视觉、触觉和本体感受)、反射和平衡测试。不能执行其中 1项测试得 1分，而没有相应测试反射扣1分,整体的综合评分用来确定损害程度。神经学评分可以评估多种神经缺陷，并能在损伤后 30~60 d 的时间内进行测试。尽管测试任务很简单，但评分可能是特定于某种形式或神经功能的，并可能被综合得分所掩盖。此外，在 mNSS 中测试的反射是耳郭和惊恐反射，这些测试项目不太可能与大脑中动脉供血区域的损伤有关。

注：无法完成其中一项任务或其中一项反射缺失则给予1分。13~18 分提示严重损害；7~12 分,中度损害；1~6 分，轻度损害。

（三）  组织学检测

1.  TTC染色（氯化三苯基四氮唑染色）

2.  HE染色

造模周期

3d

后续检测指标建议

脑组织TTC染色、伊文思蓝染色

注意事项

1.  术后实验动物的饲养和管理

保温：手术后的动物放置在一个单独的恢复笼子中,笼子的一半应该置于温度合适的电热板上。

补液：术后通过腹腔、静脉或皮下注射给予温暖(即体温)液体可以帮助动物维持血压，加快术后麻醉恢复，也可以缓解因长时间手术操作导致的脱水和血容量不足。

饲养：MCAO 术后动物会有恢复期颈部疼痛和不适的问题，常规鼠笼需要动物仰头进食和饮水,但对于术后动物而言仰头动作会造成较大的疼痛。因此,饲养术后动物需要将鼠粮和饮水放置到更容易取食的地方。常规的颗粒饲料比较硬，可以适当泡软后提供给术后动物。

观察：术后每隔 10~15 min 观察一次，直至动物能够行走。术后至少连续3 天观察动物是否出现食欲下降、过于兴奋或安静伤口延迟愈合、感染等迹象，每天至少观察并记录 1次。直至动物正常饮水摄食，转至常规饲养。

2.  手术过程中保证小鼠体温在 37°C，缺血时的温度会影响梗死体积的生成，温度过低，会由于低温保护作用，造成梗死灶体积过小或每只模型梗死体积不一致；而温度过高会加重脑损伤，导致梗死体积过大，动物容易死亡。

3.  术后应该怎样具体护理才能降低小鼠死亡率？

术后抗感染：手术后大多数动物死亡会源于术后感染，所以抗感染是重要的护理环节。首先切口周围应严格用碘伏消毒，消毒范围不应低于1.5 cm；同时，从术后当天开始，每天腹腔注射4万单位青霉素，连续注射7天；术后生活的笼具垫料也应进行严格的消毒灭菌，垫料需每天更换一次。

术后镇痛：术后切口强烈的疼痛，也是实验动物死亡因素之一。在缝合伤口后，可以选择性的以 2.5 mg/kg标准于小鼠尾静脉注射曲马多，以达到镇痛目的。

术后饮食：MCAO术后1周内，为死亡高发期，其中一个重要的原因就是术后自主进食不佳。术后应采用流食，可 以喂养奶粉，或用10%蔗糖代替。如若1天内小鼠仍没有进食行为，可以采用灌胃处理。

环境温度：术后饲养的环境温度应在 27°C±0.5°C，不宜过高，过高会出现灌注流速太大引起的脑出血，湿度为 70%±5%，通风良好，避免噪声及动物间的相互干扰。

4.  死亡原因：解剖死亡大鼠的脑，先看是否有蛛网膜下腔出血，如有出血，表明死因是进拴太深，以后注意插线深度；如无出血，则还要再看是否有严重的大脑半球水肿，如脑水肿严重，则表明死因是脑缺血时间太长，需要缩短缺血时间

5.  插栓时死亡原因：

a）麻醉剂量过深；

b）窒息：呼吸道分泌物增多，操作时压迫小鼠的气管及分离血管时损伤迷走神经，导致小鼠窒息死亡。

c）手术过程中失血过多：包括分离颈部血管时出血、血管破裂出血、血管夹闭不全出血、线栓头脱落出血、反复多次插入线栓出血等。

 拔栓时死亡原因：

a）线栓已经插破血管，拔线时导致大出血；

b）拔栓时颈外动脉没有结扎好，导致大出血；

c）再灌注会加重小鼠的大脑损伤，小鼠无法承受。

6.  缺血时间与梗死部位的关系。

纹状体比大脑皮层对缺血更为敏感，缺血30分钟内仅在纹状体梗塞，而缺血超过一个小时才会同时损伤纹状体和皮层。如果造模后发现仅出现纹状体梗死可能是线拴的深度不够，或者是缺血再灌注的时间过短，可以通过调整线拴深度或增加缺血时间来预防。

7.  永久损伤与暂时性损伤的区别

永久性缺血损伤是在脑缺血后不进行拔栓，而短暂性损伤在脑缺血60min，90min或者120min后有一个拔栓血液再灌注的过程。

判断标准：1）测脑血流：使用激光散斑血流成像系统测定小鼠两侧大脑的血流量。永久性损伤的缺血大脑血流不会恢复，比正常对侧要低很多。短暂性损伤的缺血大脑再灌注后血流能够恢复到对侧的80%左右。2）TTC染色：永久损伤的缺血性大脑损伤面积大，短暂性损伤的缺血性大脑损伤区域固定在皮层和纹状体之间。3）行为学：永久损伤的小鼠死亡率很高，行为学无法恢复。短暂性损伤的小鼠在缺血后期（14-28天）行为学能够在一定的程度上恢复正常。