产品信息

产品描述

EdU（5-溴-2-脱氧尿嘧啶）是一种嘧啶类似物，能在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中。经孵育EdU将进入所有的细胞中从而达到标记细胞的目的。将被EDU标记的细胞注入动物体内，经培养后切片、染色，即可观察EdU标记细胞的分布、分化和形态变化，适用于各种细胞，各种动物模型的标记示踪实验，在肿瘤生物学、分子生物学、遗传学、药物代谢动力学等研究中广泛应用。

光谱特性： Yefluor 647 Azide：Ex/Em=650/670 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461 nm,bound to DNA

产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20℃避光保存，有效期1年。

注意事项

操作时请采取防护措施，穿防护服、戴一次性手套等。

使用方法

1.EdU标记

1.1    按每孔1-5×10⁵细胞接种于6孔板中，培养至正常生长阶段。(可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。

1.2    制备10 mM EdU储液 如2 mg EdU(组分A) 溶于800 μL无水DMSO即可。

用细胞培养基按比例稀释EdU储液，制备适量10 μM EdU培养基，EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择。

注：1) 由于需要标记一个细胞周期，属于长时间孵育(>24 h)宜采用低浓度(1~10 μM)；

 2) 如果需配置更小浓度的EdU培养基，按相应比例稀释即可；

3) 配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。

1.3    每孔加入500 μL 10 μM EdU培养基孵育一个细胞周期，弃培养基；

注：1) 孵育时间基本上等于该细胞的细胞周期，最大限度使所有细胞都标记EdU；

            2) EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需保证EdU孵育时间内的营养物质供给。

1.4 将一个孔的细胞进行细胞标记率检测，检测方法请参考荧光显微镜细胞增殖检测。

2. 细胞移植

2.1 取适量细胞PBS清洗后，进行移植，移植方式依据实验目的而定；

2.2 移植完成后，按照实验条件继续培养；

2.3 取目的组织切片，切片类型依据客户需求而定。

3. 切片处理

3.1 切片前处理：动物器官最好进行洗涤以去除组织或器官中残留的EdU，降低背景；

3.2 切片厚度：3~10 μm为宜，切片过厚可能影响切片背景；

3.3 切片后处理：

1)石蜡切片脱蜡：二甲苯洗脱3次，10 min/次，乙醇梯度(100%，95%，85%，75%)洗脱各1次，水洗脱1次；

2)冰冻切片处理：室温放置30 min后，4℃丙酮固定10 min，PBS清洗3次，每次5 min。

3.4  2 mg/mL甘氨酸清洗10 min；

3.5 (加强)加入100 μL渗透剂(0.5% Triton X-100的PBS)脱色摇床孵育10 min；PBS清洗10 min。

4. EdU检测

注意：本参考步骤每个切片使用100 μL的Click-iT反应混合物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。

4.1 准备1× Click-iT EdU 反应缓冲液（组分C）：10× 组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。

4.2 制备一份5× 的Click-iT EdU反应添加物储液（组分E）：加0.3 mL去离子水至30 mg的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用）。

4.3 准备1× Click-iT EdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液（组分E）至1×，溶液应新鲜配置，当天用完。

4.4 依据表1 准备Click-iT反应混合物。表1要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

表1  Click-iT反应混合物

4.5 去除促渗剂，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。

4.6 加入0.1 mL Click-iT反应混合物至每个切片，使反应液均匀覆盖样本。

4.7 室温避光孵育30 min