喹乙醇代谢物(MQCA)检测
试剂盒说明书
【概述】
喹乙醇又称喹酰胺醇，商品名为倍育诺、快育灵，由于喹乙醇有中度至明显的蓄积毒性，对大多数动物有明显的致畸作用，对人也有潜在的三致性，即致畸形，致突变，致癌。因此喹乙醇在美国和欧盟都被禁止用作饲料添加剂。《中国兽药典》(2005版)也有明确规定，喹乙醇被禁止用于家禽及水产养殖。水产品喹乙醇限量标准值:0μg/kg。喹乙醇若添加于牛、羊、猪、鸡饲料中，亦能够促进畜产类生长及蛋白质同化、提高饲料利用率和增加瘦肉率。但若遭到滥用，将造成细菌耐药性增加，当人类食用或接触被抗生素污染的禽肉就可能感染具耐药性的细菌，进而危害健康。
动物食用喹乙醇药物（OLA)后，大部分的喹乙醇（OLA)会代谢为喹乙醇代谢物（MQCA)，仅有30%左右的喹乙醇残留在组织中。因此，一般用“喹乙醇的原药（OLA）试剂盒”检测饲料中的喹乙醇；而用“喹乙醇代谢物（MQCA)试剂盒”检测动物源性食品中的喹乙醇代谢物残留。
【原理】
本试剂盒是应用 ELISA 技术研发而成的检测产品，采用间接竞争一步法。在酶标板中同时加入校准品（或样本）、酶结合物及抗体，酶标板上包被的抗原与加入的校准品（或样本）中的抗原竞争结合加入的抗体，同时酶结合物与抗体结合。用 TMB 底物显色，样本吸光值与其残留物喹乙醇代谢物浓度呈负相关，与校准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中喹乙醇代谢物的含量。

【适用范围】
可定性、定量检测动物组织（鸡、鱼、虾等）中喹乙醇代谢物的残留量。
【试剂盒特性】
（一）基本特性：
灵敏度0.5ppb
线性范围0.5~40.5ppb
操作时间50min（二）样本最低检测限：
方法（组织）1ppb
（三）交叉反应率：
喹乙醇代谢物(MQCA）100%
（四）准确度：
A、鸡肉、鱼肉、虾肉80%~120%
B、鸡肉、鱼肉、虾肉80%±15%
组   织.  60%-120%
（五）精密度：
本试剂盒板内、板间变异系数<10%
【试剂盒组成】
1. 96孔酶标板： 包被有偶联抗原     1块
2.标准液×6瓶（1ml/瓶）： 0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
3.高浓度标准品（1ml/瓶） 100ppb
4. 酶结合物 7ml 红色帽
5. 抗体工作液 7ml 蓝色帽
6. 底物A液 7ml 红色帽
7. 底物B液 7ml 黑色帽
8. 终止液 7ml 黄色帽
9. 20X浓缩洗涤液 50ml 透明帽
10. 2X浓缩复溶液 50ml 透明帽
11. 盖板膜  2张
【需自备的设备及试剂】
设备：微孔板酶标仪450nm/630nm；旋转蒸发仪/氮气吹干装置；均质器；振荡器；涡旋；离心机；天平：感量0.01g刻度10ml移液管；洗耳球；量筒；10ml玻璃试管；50ml聚苯乙烯离心管。 
微量移液器：单道 20l～200l、100l～1000l
多道 250l
试剂：乙酸乙酯(分析纯)；正己烷（或正庚烷）(分析纯)；去离子水；浓硫酸；氢氧化钠(分析纯)；浓盐酸(分析纯)。
【样本前处理步骤】
（一）样本处理前须知
（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。
（b）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。
（c）未处理的样本冷冻保存。
（d）处理好的样本可在2-8℃避光保存24小时。
（e）盐酸溶液可于室温保存三个月。
（f）氢氧化钠溶液可于室温保存三个月。
（二）样本前处理方法
A、组织（鸡、鸭、鱼、虾等生鲜、肝脏）
1、称1±0.05g 均质过的组织样本于50ml离心管中；加入8ml乙酸乙酯和1ml水，振荡 5min，再加入1ml 2M硫酸（配液2），振荡30s；4000r/min以上，25℃离心5min；
2、取 4ml清澈有机相至玻璃试管中，50-60℃氮气或空气吹干；
3、加入正己烷1ml,涡旋振荡30s，再加入1ml样本复溶液，振荡混合 30s，2000r/min 25℃离心5min；
4、取下层50l液体用于分析。样本稀释倍数: 2倍 
B、组织（鸡、鸭、鱼、虾等生鲜）
1、准确称取组织样2.00±0.05g于50mL离心管中，加入4mL提取液（配液6），在涡旋振荡器上振荡5min，4000r/min离心10分钟。
2、取上清1mL加入5～10μl 5MNaOH中和至中性，震荡30s混匀。
3、取50uL用于检测。 
样本稀释倍数：2倍
【试剂的配制】
配液1：样品复溶液：把浓缩复溶液（2×）按1份浓缩复溶液+1份去离子水稀释。用于提取样本的复溶，样品复溶液在4℃环境下可保存一个月。
配液2：2M硫酸：把浓硫酸稀释9倍（即80ml水中+10ml浓硫酸即可）
配液3：洗涤工作液：用去离子水将20×浓缩洗涤液按1：19体积比进行稀释（1份20×浓缩洗涤液+19份去离子水）用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4℃环境可保存一个月。
配液4：5M 氢氧化钠：称取20.0g氢氧化钠加去离子水溶解后定容至100mL即可。
配液5：0.1M盐酸：835μl浓盐酸加入到99.16ml去离子水即可。
配液6：提取液：配制100mL0.1mol/LHCL，加入2.5gNaCL，混匀，倒出10mL，再加入10mL甲醇，混匀即可。
【检测步骤】
（一）检测前须知：
1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。
2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。
4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜盖住微孔板。
（二）具体操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗涤工作液在使用前也需回温。
4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样品：加校准品/样本50μL/孔到各自的微孔 中，然后加入酶结合物50μL/孔，再加入抗体工作液50μL/孔，用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，25℃环境反应30min。
6、洗板：取出微孔板，甩出孔内液体，用洗涤工作液按250μL/孔洗板4 次，每次浸泡30 秒，在吸水纸上拍干。
7、显色：加入底物A液50l/孔，再加底物B液50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃环境中反应15min（见注意事项8）。
8、测定：加入终止液50l/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，请在5min内读完数据），测定每孔OD值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与喹乙醇代谢物的含量成负相关。
1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。例如样本1的吸光度值为0.236，样本2的吸光度值为0.666，标准品吸光度值分别是： 0ppb为1.949；0.5ppb为1.434；1.5ppb为0.939；4.5ppb为0.487；13.5ppb为0.157；40.5ppb为0.060。则样本1的浓度范围是4.5ppb-13.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中喹乙醇代谢物残留的浓度范围；样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中喹乙醇代谢物残留的浓度范围。
2、定量分析
（1）百分吸光率的计算 
标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即

B标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B00ppb标准溶液的平均吸光度值
（2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以喹乙醇代谢物标准品浓度（ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中喹乙醇代谢物的实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）
【注意事项】
1、室温低于20℃或试剂及样本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、每加一种试剂前需要将其摇匀。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。
6、储存条件：保存试剂盒于2-8℃，不要冷冻，将不用的微孔板放进自封袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、试剂变质的迹象：发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、在加入底物A液和底物B液后，一般显色15min即可。若颜色较浅，可延长反应时间到20min（或更长），但不得超过30min。反之，则减短反应时间。
【储藏条件及保质期】
1、储藏条件：本试剂盒于 2～8℃保存，勿冷冻。
2、保 质 期：本产品有效期为 12 个月，生产日期见包装盒。