人Oct-4基因干扰载体设计及构建

摘要：设计针对human Oct-4的shRNA干扰片段。通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体（pLenti-U6-shRNA-CMV- EGFP-T2A-Puro）的U6启动子下游，该载体可以实现在干扰Oct-4基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP和puromycin抗性基因，前者便于观察载体工作状态，后者方便筛选Oct-4干扰的稳定细胞株。除了可以直接瞬时转染细胞用于Oct-4基因的干扰，该载体更可以包装慢病毒，用于稳定株的筛选以及在动物水平干扰Oct-4基因的表达。
关键词：Oct-4，RNAi， shRNA， EGFP， puromycin， lentivirus vector

一、 实验原理
RNA干扰（RNA interference， RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性降低或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。shRNA作为RNA干扰的一种方法，是利用人源和鼠源的U6和H1等RNA聚合酶Ⅲ（pol Ⅲ）启动子转录短的干扰RNA (siRNA， 19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。细胞内转录的shRNA被加工后掺入RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex， RISC），引导核酸酶降解靶RNA。
shRNA表达载体的优点在于可以进行较长期研究——带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久。病毒载体也可用于siRNA表达，其优势在于可以直接高效率感染细胞进行基因沉默的研究，避免由于质粒转染效率低而带来的种种不便，而且转染效果更加稳定。
所选用的干扰载体pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro载体图谱如下。用Age I和EcoR I酶切切去U6启动子下游的ccdB毒性基因，插入待构建的shRNA序列。

二、 实验目的
构建带有EGFP荧光标记和puromycin抗性基因标记的human Oct-4干扰慢病毒载体。

三、 实验步骤
根据human Oct-4基因的转录本设计3到4个siRNA靶点，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因。菌落PCR筛选转化子，筛选的的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤：
1. 干扰靶点设计和引物合成：
根据shRNA设计的一般原则以及和元生物的丰富经验，设计3到4个siRNA靶点，安排引物合成。
2. 引物退火形成带粘性末端的双链片段：
将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存。
3. 线性化表达载体的制备：
用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10 x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 干扰片段连接入表达载体：

                                                                连接反应体系
     

         于16℃ 连接过夜。

说明：阳性对照所加的退火的双链oligo是以前退火好的验证好用的片段，和连接组所加的退火的双链oligo长度一样，但序列无关。
5. 感受态细胞的转化：
DH5α感受态细胞的转化，详见《精编分子生物学实验指南》。
6. 菌落PCR鉴定阳性转化子：
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中，取1µl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

7. 阳性克隆送测序：
菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析。
8. 质粒小提：
经测序验证正确的阳性克隆，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. siRNA 序列和引物合成：
                                                                 siRNA 序列

病毒载体构建框架

DNA引物片段：
pY1001-1  CCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTG
pY1001-2  AATTCAAAAAAAGAAAGAACTCGAGCAATTTCTCTTGAGAATTGCTCGAGTTCTTTCT　
pY1002-1  CCGGCCGTGAAGCTGGAGAAGGATTCAAGAGATCCTTCTCCAGCTTCACGGTTTTTTG
pY1002-2  AATTCAAAAAACCGTGAAGCTGGAGAAGGATCTCTTGAATCCTTCTCCAGCTTCACGG　
pY1003-1  CCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTG
pY1003-2  AATTCAAAAAAGCTTCAAGAACATGTGTAATCTCTTGAATTACACATGTTCTTGAAGC　
pY1004-1  CCGGGGGAGGAGCTAGGGAAAGATTCAAGAGATCTTTCCCTAGCTCCTCCCTTTTTTG
pY1004-2  AATTCAAAAAAGGGAGGAGCTAGGGAAAGATCTCTTGAATCTTTCCCTAGCTCCTCCC　
pYNC-GP-1  CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG
pYNC-GP-2  AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGAA

2. 表达载体的线性化：
用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切，胶回收8.2kb的载体片段，酶切图谱如下：
               1    2    3

          
1. 空质粒
2. 1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3. 经Age I和EcoR I双酶切的pLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-T2A-Puro载体

3. 菌落PCR鉴定阳性克隆：
用菌落PCR鉴定转化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6启动子序列中，反向引物pY-SEQR：  CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5’序列，阳性克隆得到331bp的片段，阴性对照得到586bp的片段。
pY1001菌落PCR鉴定图：

      1    2     3      4      5     6      7      8     9     10    11

1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子

pY1002菌落PCR鉴定图：
    1    2      3      4      5     6       7     8     9      10   11

 
1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子

pY1003菌落PCR鉴定图：

     1      2      3      4      5     6       7     8      9     10    11

 
1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子

pY1004菌落PCR鉴定图：

      1    2      3      4      5     6      7      8      9    10    11

1. 阴性对照（空载体）
2. 阳性对照（pYNC-GP质粒）
3. DL2,000 DNA  Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.  挑取的8个转化子

4. 测序结果分析：
pY1001测序结果：
CCCCCCCATATCCAGCCTGTTGAGAGAATTGGATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGAGAAAGAACTCGAGCAATTCTCAAGAGAAATTGCTCGAGTTCTTTCTTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCATGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGTCGAGCTGGACGCGACGTAACGCACAGTTCAGCGTGTCGGCGAGGGCGAGGCGATGCCACCTACCGCAGCTGACCTGAAGTCATCTGACACGCAGCTGCTGACTTGACCACCTTTGACACCTGACTACGCGTGATGTCAGCGTAACCGACCATGAGACGACTCTCTAGTCCATGCCAGACTTCTAGAGGACAATTCTTCGAAGATAGAAGCGG

pY1002测序结果（由于发夹结构，2个阳性克隆均测序中断）：
pY1003测序结果：
CAACCGGGCTTGGTTAGAGAGACATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAcAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGCTTCAAGAACATGTGTAATTCAAGAGATTACACATGTTCTTGAAGCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACGGGACGCCACCATGTGAGCAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCTGTCGAGCTGACGCGACGTAACGCACAGTCAGCGTGTCGGCAGGCGAGGCGATGCACTACGCAGCTGACCTGAGTCATCTGCACACGCAGCTGCGTGCCTGTACTCGTGACCACCTGACCTACGCTGCATGCTCAGCGCTACCCGACCATGAAGCACCGACTCTCAGTCGCATGCCGAAGGCTCGTCCGGAGGCCAACTTCCAGGCACGGCATTCAGATCCCACCAGGTGAAGTTCCAGGGG

pY1004测序结果（由于发夹结构，2个阳性克隆均测序中断）：
pYNC-GP测序结果：
CTTTAATATACTTTGACTGTAAAAACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGT

TTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGGACGCCACCATGATGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACTTACGGGCAGCTGAACCCTTGAAAGTTCATCTGGCCCACCGGCAAGCTTGCCGTGACCTTGACCAGCCATCGTAACCACCCTGACCTACGCGTGCATGCTTCGGCGCTAACCCGGACATGAGCAGCACGGACTTCTTCAAGTTCGGCATGGCCGAGCTACGTCAGAGCGACATCTCTTCAAGACGACGCACTACAGATCCGACGCAGAGTGTAAATCA

五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著，马学军等译，精编分子生物学实验指南（第四版），科学出版社