乙酸激酶测定试剂盒产品内容：

提取液：液体50mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体30mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前每瓶加入4mL双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍4℃保存；

试剂三：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入3mL双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

试剂四：粉剂×2瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入2mL双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

试剂五：粉剂×1支，-20℃保存；临用前每支加入1mL双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂-20℃保存；

试剂六：液体43μL×2支，4℃保存；临用前每支加入457μL双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存；

试剂七：液体50μL×2支，-20℃保存；临用前每支加入450μL双蒸水，充分溶解待用；用不完的试剂仍4℃保存；

试剂八：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入5mL双蒸水，充分溶解待用。用不完的试剂仍4℃保存。

工作液：吸取0.3mL 试剂二、1mL试剂三、0.65mL试剂四、0.2mL试剂五、0.2mL试剂六、0.2mL试剂七、1mL试剂八混匀，也可根据比例现用现配。于冰上备用。

产品说明：

ACK广泛存在于生物体内，催化乙酸和ATP生成乙酰磷酸和ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理如下：（1）ACK催化乙酸钠和ATP生成乙酰磷酸和ADP，（2）丙酮酸激酶催化ADP和PEP生成ATP和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和NADH生成乳酸和NAD+，（4）在340nm下测定NADH氧化生成NAD+速率，即可反映ACK活性。

自备实验用品及仪器

  台式离心机、紫外分光光度计、水浴锅、1mL石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、蒸馏水。

乙酸激酶测定试剂盒操作步骤：

一、样品前处理：

1、细菌或细胞处理：

收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率20％，超声3秒，间隔10秒，重复30次），15000g，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测。

2、组织处理：

称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆；15000g ，4℃，离心20分钟，取上清，置冰上待测

3、血清（浆）：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）保温15min。

3、 操作表：

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中，加样本的同时开始计时，在340nm波长下记录20秒时的初始吸光度A1，比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应3分钟；迅速取出比色皿并擦干，340 nm下比色，记录3分20秒时的吸光度A2，计算ΔA测定=A测定1-A测定2，ΔA空白=A空白1-A空白2，计算ΔA=ΔA测定-ΔA空白。

三、乙酸激酶测定试剂盒ACK活性计算：

1、 组织中ACK活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/mg prot）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每g组织每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/g 鲜重）= [ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V提取×W) ÷T=536×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/10⁴ cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样÷V样总×500) ÷T=1.072×ΔA

（4）按血清体积计算：

单位的定义：每mL血清（浆）中消耗1 nmol的NADH定义为一个酶活力单位。

ACK（U/mL）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷V样 ÷T=536×ΔA

V反总：反应体系总体积，0.001L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；          V样：加入样本体积，0.1 mL；V提取：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。

2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3、吸光值大于1时，建议稀释后测量，注意计算公式乘以稀释倍数；吸光值小于0.01时，建议延长反应时间测量，注意计算公式变化。

相关产品

BC2030 异柠檬酸裂解酶(ICL)检测检测试剂盒 紫外分光光度法 50管/48样

BC2035 异柠檬酸裂解酶(ICL)检测检测试剂盒 微量法 100管/96样

BC3170 乙酸激酶(ACK)检测试剂盒 紫外分光光度法 50管/48样

BC3175 乙酸激酶(ACK)检测检测试剂盒 微量法 100管/96样

BC0010 单胺氧化酶检测检测试剂盒 可见分光光度法 50管/48样

BC0015 单胺氧化酶检测检测试剂盒 微量法 100管/96样

BC1140 肌酸激酶检测检测试剂盒 紫外分光光度法 50管/48样

BC1145 肌酸激酶检测检测试剂盒 微量法 100管/96样

BC3120 植物脱氢酶(PDHA)检测检测试剂盒 可见分光光度法 50管/24样

BC3125 植物脱氢酶(PDHA)检测检测试剂盒 微量法 100管/48样

BC3130 甜菜碱检测检测试剂盒 可见分光光度法 50管/48样

BC3135 甜菜碱检测检测试剂盒 微量法 100管/96样

BC0440 二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶检测检测试剂盒 紫外分光光度法